酶活分光光度試劑盒通過連續記錄光吸收的增加速率來計算酶促反應速度。使用HITACHI日立分光光度計或酶標儀實時監測這一過程，獲得準確的反應曲線數據。分光光度法的核心基于朗伯-比爾定律，即溶液中物質對特定波長光的吸收程度與其濃度成正比。當單色光通過均勻有色溶液時，部分光線被吸收，未被吸收的光強變化可反映溶質濃度。
 

　　顯色反應與產物定量：例如，LDH催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸后，后者進一步與2,4-*肼作用形成棕紅色化合物，該化合物在堿性條件下的顏色深淺直接對應丙酮酸含量，從而間接反映酶活性；另一種方法是DNS比色法，如植物蔗糖酶分解蔗糖產生的還原糖與3,5-二硝基水楊酸反應生成棕紅色產物，其在540nm處的吸光值可用于量化酶活。

 

　　酶活分光光度試劑盒的測定步驟：
 

　　1.準備工作
 

　　-檢查試劑與器材：確認試劑盒內包含所有試劑和說明書，并核實其保存條件及有效期限；同時準備好離心機、吸管、移液器等實驗所需儀器和耗材。
 

　　-樣本準備：根據實驗設計獲取待測樣本，確保樣本數量和質量符合要求。若樣品濃度過高，需提前進行預測并適當稀釋至試劑盒檢測范圍內，計算時乘以相應的稀釋倍數。
 

　　2.加樣操作
 

　　-設置對照與樣本孔：分別設立空白孔、標準孔和待測樣品孔。空白孔加入樣品稀釋液(如100μl)，其余孔依次加入標準品或待測樣品(同樣為100μl)。注意避免產生氣泡，將液體加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁。
 

　　-混勻處理：在試劑或樣品稀釋時充分混勻，但應盡量避免起泡，以保證反應體系的均勻性。
 

　　3.反應與測定
 

　　-啟動反應：按照說明書指示添加特定底物或輔酶等啟動劑，引發酶促反應。不同試劑盒可能涉及不同的生化反應機制(如NAD+/NADH互變、顯色產物生成等)。
 

　　-分光光度檢測：使用HITACHI日立分光光度計在預設波長下讀取各孔的吸光度值。例如，某些試劑盒通過監測還原型輔酶Ⅰ的變化來量化酶活性。
 

　　4.數據分析
 

　　-根據標準曲線計算待測樣品中的酶活性單位，結合稀釋倍數得出結果。