腫瘤細胞原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[(digoxigenin)-11-dUTP]在TdT酶的作用下,可以摻入到凋亡細胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端,與dATP形成異多聚體,并可與連接了報告酶(過氧化物酶或堿性磷酸酶)的抗地高辛抗體結合.在適合底物存在下,過氧化物酶可產(chǎn)生很強的顏色反應,特異準確的定位出正在凋亡的細胞,因而可在普通光學顯微鏡下進行觀察.

毛地黃植物是地高辛的*來源.在所有動物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結合的配體,因而非特異性反應很低.抗地高辛的特異性抗體與脊椎動物甾體激素的交叉反應不到1%,若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后,則可*排除細胞Fc受體非特異性的吸附作用.

(一)試劑配制

1、磷酸緩沖液PBS(pH7.4)：磷酸鈉鹽 50mM,NaCl 200mM.

2、蛋白酶K(200μg/ml,pH7.4)：蛋白酶K 0.02g;PBS 100ml.

3、含2%H2O2的PBS緩沖液(pH7.4)：H2O2 2.0ml;PBS緩沖液 98.0ml.

4、TdT酶緩沖液(新鮮配)：Trlzma堿 3.63g用 0.1N HCl調(diào)節(jié)pH至 7.2,加ddH2O定容到1000ml;

5、TdT酶反應液：TdT酶32μl;TdT酶緩沖液 76μl,混勻,置于冰上備用.

6、洗滌與終止反應緩沖液：氯化鈉 17. 4g;檸檬酸鈉 8.82g;ddH2O 1000ml

7、0.05%二氨基聯(lián)苯(DAB)溶液：DAB 5mg;PBS 10ml,pH7.4, 臨用前過濾后,加過氧化氫至0.02%.

8、0.5%甲基綠(pH4.0)：甲基綠0.5g;0.1M乙酸鈉100ml.

9、100%丁醇,100%、95%、90%、80%和70%乙醇,二甲苯,10%中性甲醛溶液,乙酸,松香水等.

10、過氧化物酶標記的抗地高辛抗體(ONCOR)

(二)腫瘤細胞實驗步驟

1、標本預處理：

(1)石蠟包埋的組織切片預處理：將組織切片置于染色缸中,用二甲苯洗兩次,每次5min.用無水乙醇洗兩次,每次3min.用95%和75%乙醇各洗一次,每次3min.用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液(20ug/ml),于室溫水解15min,去除組織蛋白.用蒸餾水洗4次,每次2min,然后按下述步驟2進行操作.

(2)冰凍組織切片預處理：將冰凍組織切片置10%中性甲醛中,于室溫固定10min后,去除多余液體.用PBS洗兩次,每次5min.置乙醇：乙酸(2：1)的溶液中,于-20℃處理5min,去除多余液體.用PBS洗兩次,每次5min,然后按下述步驟2進行操作.

(3)培養(yǎng)的或從組織分離的細胞的預處理：將約 5 × 107個/ml細胞于 4%中性甲醛室溫中固定 10min.在載玻片上滴加 50～100μl細胞懸液并使之干燥.用PBS洗兩次,每次5min,然后按下述步驟2進行操作.

2、色缸中加入含2%過氧化氫的PBS,于室溫反應5min.用PBS洗兩次,每次5min.

3、用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體,立即在切片上加2滴 TdT酶緩沖液,置室溫1～5min.

4、用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體,立即在切片上滴加 54μl TdT酶反應液,置濕盒中于37C反應 1hr(注意：陰性染色對照,加不含TdT酶的反應液).

5、將切片置于染色缸中,加入已預熱到37℃的洗滌與終止反應緩沖液,于37℃保溫30min,每10min將載玻片輕輕提起和放下一次,使液體輕微攪動.

6、組織切片用PBS洗 3次,每次 5min后,直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標記的抗地高辛抗體,于濕盒中室溫反應30min.

7、用PBS洗4次,每次5min.

8、在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05%DAB溶液,室溫顯色3～6min.

9、用蒸餾水洗4次,前3次每次1min,zui后1次5min.

10、于室溫用甲基綠進行復染10min.用蒸餾水洗3次,前兩次將載玻片提起放下10次,zui后1次靜置30s.依同樣方法再用100%正丁醇洗三次.

11、用二甲苯脫水3次,每次2min,封片、干燥后,在光學顯微鏡下觀察并記錄實驗結果.

(三)腫瘤細胞注意事項

細胞凋亡檢測試驗中一定要設計陽性和陰性對照樣本。可以采用不加TdT酶的作為陰性對照組，利用DNaseI部分降解的細胞作為陽性對照組。