1、將抗原和淋巴細(xì)胞系在體外混合，刺激并預(yù)孵育，是通用的方法。預(yù)孵育的淋巴細(xì)胞，在置入ELISPOT板之前應(yīng)使用復(fù)溫到37℃的培養(yǎng)液清洗細(xì)胞1-2次。置入ELISPOT板以后通常在37℃培養(yǎng)5～6小時。

2、對于高度特異性抗原，可以采用將淋巴細(xì)胞和抗原同時加入ELISPOT板孔中，37℃培養(yǎng)箱中，同步進(jìn)行刺激、培養(yǎng)、和細(xì)胞因子捕獲。淋巴細(xì)胞板內(nèi)同步刺激培養(yǎng)的時間通常為22～24小時。

3、ELISPOT試驗檢測的是每一個分泌細(xì)胞系因子的活化細(xì)胞。在培養(yǎng)細(xì)胞過程中，任何移動、震動（包括開關(guān)培養(yǎng)箱門）都會導(dǎo)致細(xì)胞在培養(yǎng)板上的移動，從而得到不規(guī)則斑點(diǎn)或者斑點(diǎn)花紋，影響zui終結(jié)果。因此細(xì)胞在ELISPOT培養(yǎng)板孵育的過程中，應(yīng)注意保持培養(yǎng)板的靜置，不應(yīng)對其移動。

4、在使用抗原刺激淋巴細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變黃，這種現(xiàn)象通常見于使用很強(qiáng)的多克隆抗原刺激淋巴細(xì)胞，某些多克隆抗原會導(dǎo)致淋巴細(xì)胞凋亡或者死亡，大量淋巴細(xì)胞死亡后使培養(yǎng)液變黃。使用這些淋巴細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)ELISPOT試驗通常得到很低的斑點(diǎn)（SPOT）形成。換用特異性抗原后可以避免該現(xiàn)象。

5、在ELISPOT結(jié)果中出現(xiàn)不規(guī)則的大塊斑點(diǎn)，有的區(qū)域沒有斑點(diǎn)的原因，不規(guī)則斑點(diǎn)區(qū)域的出現(xiàn)一般是細(xì)胞分離不*所至，有時候采用多克隆抗原孵育的淋巴細(xì)胞也會產(chǎn)生成團(tuán)現(xiàn)象。請確認(rèn)加入到ELISPOT板中進(jìn)行孵育的是單細(xì)胞懸液。

6、使用開口較大的吸頭，動作輕柔，避免對細(xì)胞系的吹打，減少剪切力對淋巴細(xì)胞的傷害。